如何打造出艺术品般的免疫荧光图像？

        每每看到那些艺术品般的细胞图像，我们当然希望能亲手创作一幅。然而，对于固定细胞的染色，并没有理想的操作步骤，因此实验过程少不了优化。免疫荧光实验的染色过程一般分为六个步骤：样品制备、固定、透化、封闭、抗体孵育和封片。在此，赛默飞世尔的技术专家Jason Kilgore给出了一些建议，能帮助您优化每个步骤，打造出一幅精美的艺术品。 

1. 样品制备
        在培养过程中，使用正确的培养基、血清、温度和CO2浓度是必不可少的。同时请记住，您的培养方式也要与您的成像平台相契合，比如，正置显微镜通常需要盖玻片上的细胞，而倒置显微镜能够成像多孔板中的细胞。在开始免疫荧光操作之前，需要经常检查细胞的健康状况和汇合度。是否有足够的细胞？它们的形态是否符合预期？  
        Tip #1 – 在开始优化之前，确认您的细胞表达了目标抗原。这似乎很简单，但真的有许多研究人员忘了做个简单的western blot，而直接跳到免疫荧光染色。
        Tip #2 – 优化缓冲液，这方面往往被人忽视。在固定和透化之后，孵育和洗涤过程中要用到缓冲液，而使用正确的缓冲液会对信号强度产生很大的影响。大多数研究人员都使用PBS，但有些缓冲液（如PHEM或CSK）在较低pH值下使用，可能对细胞骨架或细胞质抗原有帮助。  

2. 固定
        在所有的孵育和洗涤过程中，让细胞尽可能地保持完整，这有点棘手，也非常关键。固定是维持细胞结构的关键一步。市场上出售的许多一抗都经过某种固定剂的验证，但新的抗体则需要反复优化。  
        目前有两类固定剂可供选择：醛类固定剂和有机溶剂。醛类固定剂让细胞骨架和膜上的蛋白互相交联，因此是标记这些结构中的抗原的首选方法。然而，这种方法可能对蛋白进行化学修饰并遮蔽它们，使得检测更加困难。基于甲醛的Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit就是个不错的选择，它适用于大多数细胞类型。有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮，不会通过交联而改变蛋白，但它们使蛋白变性和沉淀。对于那些深藏不露的抗原，比如细胞核中的，这种方法可能还不错。
        Tip #3 – 不要使用有机溶剂来固定那些含有荧光蛋白标签的细胞。这可能会使标记的融合蛋白变性，而没有信号。  
        Tip #4 – 对抗固定剂诱导的自发荧光。一些样品容易因固定剂诱导而产生自发荧光，这可以通过醛基的还原来缓解。戊二醛在自发荧光上特别糟糕。
        Tip #5 – 可能需要抗原修复。如果抗原被遮蔽，它往往可通过热、压力或柠檬酸盐缓冲液处理来修复。这些方法已经很成熟，而有些抗体会推荐一种方法。  

3. 透化
        透化能帮助抗体穿过细胞膜，进入固定细胞的内部。目前有许多不同的去污剂，能用于细胞透化，包括NP-40、Triton X-100、Tween-20和皂素等。  
透化的程度需要取决于抗原的位置。例如，如果您的目的蛋白位于细胞膜或细胞外基质中，您可能不需要太多的透化。不过，对于细胞间的目标，需要透化才能让抗体达到抗原。时间和浓度都需要优化，不过也可以试试Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit。
        Tip #6 – 优化您的固定和透化方法。尝试一下不同的化合物，以及不同的时间和浓度。您也要寻找状况良好的细胞或组织，以及特异的染料。有时，查查文献，说不定有用。

4. 封闭  
        封闭抗体的非特异结合，将改善免疫荧光染色的结果。牛血清白蛋白和热灭活的血清可作为非特异性的封闭剂，不过市场上也有一些商业化的产品，如BlockAid™ Blocking Solution。在抗体孵育之前，加入封闭溶液。
        Tip #7 – 仔细选择封闭溶液。不要选择与一抗同一物种的血清哦。  
        Tip #8 – 可能需要其他的封闭溶液。因染料电荷而引起的非特异性结合可通过Image-iT FX Signal Enhancer来阻断。而一些细胞和组织中常见的内源性过氧化物酶、磷酸酶或生物素，则需要特殊的方法来封闭。

5. 抗体孵育  
        真正的检测步骤包括用一抗以及染料标记的二抗孵育细胞或组织。同样，终浓度和孵育时间都必须精心优化，对于培养细胞的显微镜观察，通常为0.5-10 µg/mL，室温下30-60分钟。多个一抗可在同一步骤中混合使用。
        一抗的检测还必须有一个染料标记的二抗，它针对一抗的宿主物种。在使用多个一抗时，要确保不同的二抗经过其他物种的交叉吸附，以免造成信号混乱。当然，染料要与滤光片匹配，而且最好是明亮又稳定的，如Alexa Fluor染料。  
        Tip #9 – 使用最好的一抗。这是整个过程中最重要的一部分。如果做好了，您将得到一个马上能发表的结果。完美的抗体有着良好的亲和力和特异性，您值得拥有。不过如果您自己制备，记得花时间设计好抗体。
        Tip #10 – 使用适当的对照。您需要一个无一抗（只有二抗）的对照来检验二抗的特异性。同时，无抗体或染料的对照可检测自发荧光。如果使用多个一抗，记得开展单个抗体的对照实验，以检验交叉标记。  

6. 封片
        一旦最后一次洗涤完成，标记好的样品将放在成像环境中，最佳地保留染料信号。尽管放在缓冲液中的细胞也能成像，但最佳的选择是将细胞放在抗淬灭的封片剂中，保留初始信号并减少光漂白，而且折射率足够高，可带来出色的分辨率。  
        Tip #11 – 选择适合您的成像时间的抗淬灭剂。如果您马上成像，然后丢掉玻片，抗淬灭剂可以是液态的，比如SlowFade Diamond。不过，如果您想保留这块玻片，迟一点再成像，那么您可以选择ProLong Diamond，它在24小时内固化。